www.zakazenia.org.pl

  

 
3/2014 

 

 

 

 

 
 

 

 
 
 
Czy czyta Pan/Pani najnowszy numer Zakae?
Poka wyniki
 

 

suplement jabłkowski  

 

 
2013
2012
2011
2010
2009
2008
2007
2006
2005
2004
2003
2002
 

 

 
 
 
 
4/2005


Konsensus dotyczcy identyfikacji specjalnych mechanizmw opornoci i interpretacji wynikw bada antybiotykowraliwoci bakterii Gram (+) i Gram (-) - tumacz. Jacek Brych



KONSENSUS DOTYCZCY IDENTYFIKACJI SPECJALNYCH MECHANIZMW OPORNOCI I INTERPRETACJI WYNIKW BADANIA ANTYBIOTYKOWRALIWOCI BAKTERII GRAM(+)

I GRAM(–) (CZ. II)

KONSENSUSPAPIER ZUR IDENTIFIZIERUNG VON SPEZIELLEN RESISTENZMECHANISMEN UND ZUR INTERPRETATION VON ERGEBNISSEN DER ANTIBIOTIKAEMPFINDLICHKEITSTESTUNG BEI GRAMPOSITIVEN UND GRAMNEGATIVEN ERREGERN*

H. K. Geiss

D. Mach

H. Seifen

tumacz. Jacek Brych

Oporno MLSB u gronkowcw i paciorkowcw

Oporno na makrolidy i linkozamidy, warunkuj trzy mechanizmy [1, 2]:

- zmiana miejsca wizania na rybosomach spowodowana metylacj lub mutacj (target-site modification);

- mechanizm aktywnego usuwania antybiotyku z komrki (efflux);

- enzymatyczna inaktywacja.

Najwaniejsze s dwa pierwsze mechanizmy. Enzymatyczna inaktywacja antybiotykw odgrywa jedynie podrzdn rol. Mechanizm dziaania makrolidw i innych przedstawicieli antybiotykw MLSB, do ktrych nale linkozamidy, ketolidy i streptograminy grupy B (tab. 1), polega na zablokowaniu syntezy bakteryjnych biaek przez wizanie si tych antybiotykw w centrum peptydylotransferazy, w obrbie podjednostki 50S rybosomw bakterii, co prowadzi do zahamowania translacji mRNA [1, 2]. Makrolidy wi si z nukleotydami A2058 i A2059 domeny V podjednostki 23S rRNA oraz w mniejszym stopniu – z nukleotydem A752 domeny II. W przeciwiestwie do makrolidw ketolidy charakteryzuj si znacznie silniejszym wizaniem si z A752. W wyniku wizania antybiotykw dochodzi do zablokowania biakowych kanaw wyjciowych podjednostki 50S rybosomu i przerwania wyduania acucha peptydowego.

Makrolidy i ketolidy upoledzaj prawdopodobnie take proces tworzenia si nowych podjednostek 50S rybosomw bakterii z prekursorw, ktrymi s m.in. 5S i 23S rRNA [3].

Modyfikacja miejsca docelowego

Metylacja rybosomalnego miejsca wizania. Metylacja miejsca wizania A2058 23S rRNA w obrbie duej podjednostki 50S rybosomu prowadzi do zmian konformacyjnych 23S rRNA. Zapobiega to wizaniu erytromycyny do jej miejsca docelowego (podobnie jak i innych makrolidw – przyp. tum.) [2]. Wskutek nakadajcych si miejsc wizania utrudnione jest rwnie wizanie linkozamidw i streptogramin grupy B, co prowadzi do krzyowej opornoci na wszystkie makrolidy, linkozamidy i streptograminy grupy B (tzw. fenotyp opornoci MLSB). Zachowana zdolno wizania z domen II (A752) powoduje, e aktywno ketolidw wobec S. pneumoniae, S. pyogenes i innych paciorkowcw ulega z reguy nieistotnemu obnieniu (MIC 0,06–1 mg/l w stosunku do 0,004–0,015 mg/l dla „dzikich” szczepw S. pneumoniae). Dla S. aureus o indukowalnej opornoci MLSB (patrz poniej) wartoci MIC zawieraj si midzy 0,06 i 0,25 mg/l, natomiast w wypadku konstytutywnej ekspresji opornoci MLSB wynosz 128 mg/l [4]. Enzym metylaza odpowiedzialny za proces metylacji jest kodowany przez geny erm (erythromycin ribosome methylase), ktre s przenoszone przez plazmidy lub transpozony. Opisano dotd ponad 40 rnych genw erm. Najwaniejsze z nich nale do klas erm (A) i erm (C) – u gronkowcw oraz do klasy erm (B) – u paciorkowcw i enterokokw.

Ekspresja opornoci MLSB moe by konstytutywna lub indukowalna. W pierwszym wypadku aktywny mRNA, umoliwiajcy syntez metylazy jest tworzony bez udziau induktora, w drugim – (indukowalna oporno MLSB) syntetyzowany jest nieaktywny mRNA, ktry ulega uaktywnieniu dopiero w obecnoci induktora, co prowadzi do produkcji enzymu. Indukcja ta zaley od obecnoci atenuatorw w grnej czci pasma genu erm. Bakteryjne szczepy z indukowalnym genem erm s oporne na induktory, ale pozostaj wraliwe na nieinduktory, takie jak np. klindamycyna i telitromycyna. Konstytutywna produkcja metylazy prowadzi do ujawnienia si powyej wspomnianego, charakterystycznego fenotypu opornoci MLSB, natomiast indukowalna oporno na makrolidy powoduje wystpowanie zrnicowanych fenotypw opornoci.

Ekspresja opornoci MLSB u gronkowcw. U gronkowcw metycylinoopornych dominuj geny klasy erm (A) kodowane na transpozonach. U metycylinowraliwych szczepw za oporno na makrolidy s odpowiedzialne geny klasy erm (C) przenoszone na plazmidach. Przy indukowalnej ekspresji fenotypy opornoci s podobne, a szczepy wykazuj oporno na makrolidy z 14- i 15-czonowym piercieniem laktonowym, funkcjonujce jako induktory. Makrolidy z 16-czonowym piercieniem laktonowym, linkozamidy, streptograminy grupy B i ketolidy nie s induktorami i zachowuj aktywno. Mutacja punktowa w regionie atenuatora indukowalnej metylazy erm C moe prowadzi do przejcia indukowalnej ekspresji opornoci w konstytutywn ekspresj MLSB. In vitro w obecnoci linkozamidw dochodzi do selekcji konstytutywnie opornych mutantw z czstoci 1:107 jtk (jednostek tworzcych kolonie) [2]. W przypadku zakae wysokimi inokulami bakterii, jak zapalenie puc, zapalenie rdpiersia, czy rozlege infekcje skry i tkanek mikkich, selekcja moe nastpowa rwnie in vivo przy zastosowaniu leczenia z uyciem linkozamidw, co prowadzi do nieskutecznoci terapii [5]. Take dla ketolidw opisywana jest selekcja in vitro konstytutywnie opornych mutantw (T. Wichelhaus, Frankfurt, informacje wasne).W zwizku z tym oba antybiotyki nie stanowi zalecanej opcji terapeutycznej w stosunku do zakae powodowanych gronkowcami o indukowalnej opornoci MLSB (tab. 2).

Ekspresja opornoci MLSB u paciorkowcw i enterokokw. W tym wypadku oporno uwarunkowana jest z reguy genami klasy erm (B), natomiast rzadziej genami podgrupy erm(TR) klasy erm (A). Indukowalna oporno na makrolidy, wystpujca czciej u S. pyogenes ni u S. pneumoniae [6], moe – w przeciwiestwie do gronkowcw – prowadzi do cakowicie rnych fenotypw opornoci. Obserwuje si przy tym zarwno niski, jak i wysoki stopie opornoci na makrolidy oraz wraliwo lub oporno na klindamycyn.

U paciorkowcw jako induktor opornoci MLSB funkcjonuje wikszo antybiotykw MLS wcznie z makrolidami o 16-czonowym piercieniu laktonowym i klindamycyn, natomiast z wyczeniem telitromycyny [3, 7]. Podobnie, jak w wypadku gronkowcw, u paciorkowcw z indukowaln opornoci MLSB odradza si terapi z uyciem klindamycyny [2], natomiast ketolidy zachowuj swoj skuteczno [4].

Mutacje miejsca docelowego. Mutacje w zakresie miejsca wizania A2059 na rybosomie oraz w obrbie genw kodujcych rybosomalne biaka L4 i L22 stanowi dalsze mechanizmy, ktre prowadz do nabywania opornoci S. pneumoniae na makrolidy, ale nie na klindamycyn [8]. Mutacje w pozycji 2058 (A2058G u S. pneumoniae) prowadz natomiast do rozwoju klasycznej opornoci MLSB. Czsto i kliniczne znaczenie tych i innych mutacji nie zostay jednak dotychczas wyjanione.

Mechanizm aktywnego usuwania antybiotykw z komrki (efflux)

U bakterii Gram(+) mechanizm ten, prowadzcy do nabywania opornoci na makrolidy, wie si z dwoma systemami transportu. W wypadku gronkowcw s to transportery (biaka bonowe – przyp. tum.) ABC (ATP binding cassette) kodowane przez geny msr (A) (macrolide streptogramin resistance)

a przenoszone na plazmidach. Transportery te funkcjonuj jako specyficzna pompa usuwajca z komrki makrolidy o 14- i 15-czonowym piercieniu laktonowym oraz streptograminy grupy B. Makrolidy o 16-czonowym piercieniu laktonowym, linkozamidy i telitromycyna nie s transportowane. Wynikajcym z tego fenotypem opornoci jest fenotyp MSB. Makrolidy o 16-czonowym piercieniu laktonowym, klindamycyna, telitromycyna oraz streptograminy grupy A zachowuj skuteczno wobec szczepw charakteryzujcych si tym mechanizmem opornoci [2, 3, 7]. W wypadku S. pneumoniae,

S. pyogenes, S. agalactiae i innych gatunkw paciorkowcw oraz u enterokokw mechanizm efflux jest uwarunkowany obecnoci transporterw MSF (major facilitator superfamily), kodowanych przez geny mef (A) (macrolide-specific efflux). Dotyczy on tylko makrolidw o 14- i 15-czonowym piercieniu laktonowym. Nie dotyczy natomiast makrolidw o 16-czonowym piercieniu laktonowym, ketolidw, linkozamidw i streptogramin grupy B. Wynikajcy z tego fenotyp opornoci okrela si jako fenotyp M. Z reguy towarzyszy on niskiemu stopniowi opornoci na makrolidy [9].

Enzymatyczna inaktywacja. Enzymatyczna inaktywacja antybiotykw MLS nie odgrywaa jak dotd wikszej roli. Z czstoci < 1% u S. aureus i z czstoci 1–7% u gronkowcw koagulazo-ujemnych wystpuje kodowana przez geny lnu (A) i lnu (B) linkozamido-nukleotydylotransferaza, ktra warunkuje nabywanie opornoci szczepw na linkomycyn, ale nie na klindamycyn. Dlatego te wykrycie tego mechanizmu opornoci jest moliwe tylko z zastosowaniem linkomycyny. U szczepw charakteryzujcych si tym mechanizmem opornoci i tak ju sabe bakteriobjcze dziaanie klindamycyny zostaje cakowicie utracone [10].

Epidemiologia

W ostatnich latach na caym wiecie doszo u S. pneumoniae i w niewielkim stopniu rwnie u S. pyogenes do znacznego wzrostu czstoci opornoci na makrolidy [9]. Czsto wystpowania opornoci w Niemczech mieci si obecnie w odniesieniu do S. pneumoniae pomidzy 15 a 25%, a w wypadku S. pyogenes wynosi okoo 14% [11]. W takich krajach, jak Francja, Hiszpania i Wgry, u S. pneumoniae przewaa (ponad 95%) mechanizm opornoci uwarunkowany genami erm (B) i tym samym fenotyp MLSB, w Niemczech za prawie tak samo czsto stwierdza si oporno warunkowan genami erm (B), jak i mef (A) (fenotyp M), natomiast w USA dominuje (powyej 60%) oporno uwarunkowana genem mef (A) – fenotyp M [12]. Te regionalne rnice w wystpowaniu rnych mechanizmw opornoci u S. pneumoniae musz by uwzgldnione w empirycznej terapii pozaszpitalnych zakae drg oddechowych (szczeglnie pozaszpitalnego zapalenia puc), w rozwoju ktrych decydujc rol odgrywaj pneumokoki. Jeli bowiem wystpuje przewaga opornoci niskiego stopnia, uwarunkowana mechanizmem aktywnego usuwania lekw z komrki, makrolidy maj jeszcze pewne znaczenie terapeutyczne, lecz jeli przewaa oporno MLSB, warunkowana genami erm, ich zastosowanie naley dokadnie rozway. Czsto wystpowania opornoci MLSB u S. aureus cile koreluje z czstoci wystpowania MRSA. Oznacza to, e u szczepw MRSA w ponad 80% przypadkw wystpuje jednoczenie, z reguy konstytutywna, oporno MLSB, uwarunkowana genami erm (A). Wrd szczepw MRSA oporno na makrolidy zalena od mechanizmu efflux wystpuje wyjtkowo rzadko [13]. Dla szczepw MSSA czsto wystpowania opornoci na makrolidy wynosi obecnie w Niemczech 14%, a opornoci na klindamycyn – okoo 3% (PEG-Studie 2001, M. Kresken, Bonn, informacje wasne). W badaniu europejskim czsto wystpowania fenotypu opornoci MLSB wrd opornych na makrolidy szczepw MSSA wyniosa 82% (prawie tak samo czsto wystpowa konstytutywny i indukowalny fenotyp opornoci). W wypadku opornoci uwarunkowanej mechanizmem efflux (fenotyp MSB) sigaa tylko 13% [13].

Diagnostyka

Wykrywanie opornoci na makrolidy za pomoc popularnych metod, takich jak metoda dyfuzyjno-krkowa, metoda seryjnych rozciecze w agarze i w bulionie, a take stosujc oglnie uznane wartoci graniczne dla rednic stref zahamowania wzrostu lub MIC, nie stanowi problemu. Ze wzgldu na istniejc zawsze oporno krzyow

w obrbie makrolidw o 14- i 15-czonowym piercieniu laktonowym celowe jest badanie erytromycyny jako reprezentanta caej grupy. Za reprezentanta grupy linkozamidw uznaje si klindamycyn.

Problemem jest natomiast fenotypowe wykrywanie poszczeglnych mechanizmw opornoci, ktre maj przecie istotny wpyw na skuteczno antybiotykw z grupy MLS, a zwaszcza klindamycyny, streptogramin i ketolidw. Najprostszym i najbardziej niezawodnym fenotypowym testem wykrywania indukowalnej lub konstytutywnej opornoci MLSB, uwarunkowanej genami erm jest test dyfuzji z krka w agarze w formie testu zblieniowego dwch krkw (DD-test). W tecie tym stosuje si jeden krek testowy z erytromycyn (15 mg) i jeden krek testowy z klindamycyn (2 mg). Krki nanosi si na pytk agarow w odlegoci okoo 25 mm od siebie [6, 14]. Konstytutywn oporno MLSB charakteryzuje oporno na erytromycyn i klindamycyn.

Indukowaln oporno MLSB mona stwierdzi na podstawie antagonizmu midzy erytromycyn i klindamycyn; daje si on rozpozna dziki powstawaniu szerokiej strefy zahamowania wzrostu wok krka z klindamycyn, spaszczonej od strony krka z erytromycyn (strefa zahamowania wzrostu w ksztacie litery D) (ryc. 1). Jeli jest stwierdzona oporno na erytromycyn, ujemny wynik DD-testu wiadczy o wystpowaniu opornoci na makrolidy, uwarunkowanej mechanizmem aktywnego usuwania antybiotykw z komrki, a wic o fenotypie MSB u gronkowcw (ryc. 2) lub o fenotypie M u S. pneumoniae i u innych paciorkowcw.

Wartoci MIC dla erytromycyny u S. pneumoniae w wypadku opornoci MLSB, uwarunkowanej genami erm s z reguy wysze (MIC90 128 mg/ml) ni w wypadku opornoci na makrolidy uwarunkowanej mechanizmem efflux – warto MIC90 16 mg/ml (zakres 0,5–64 mg/ml) [12]. Jednake z uwagi na nakadanie si zakresw wartoci MIC, obserwowanych u szczepw S. aureus i S. pneumoniae, opornych na makrolidy z opornoci uwarunkowan genami erm i z opornoci uwarunkowan mechanizmem efflux, nie jest moliwe pewne rozgraniczenie obu najwaniejszych mechanizmw opornoci, szczeglnie w zakresie rednich wartoci MIC, tj. dla erytromycyny w zakresie 4–32 mg/ml. Stanowi to problem dla zautomatyzowanych systemw oznaczania opornoci, ktre pracuj tylko stosujc metod analizy ste granicznych lub takich, ktre przyjmuj warto MIC dla erytromycyny, wynoszc 8 mg/ml.

Ostateczne wykazanie wystpujcego mechanizmu opornoci jest moliwe jedynie za pomoc metod biologii molekularnej, takich jak np. amplifikacja odpowiednich genw opornoci metod PCR [12].

Interpretacja wynikw bada

Gronkowce (tab. 2). Stwierdzenia konstytutywnego fenotypu opornoci MLSB (genotyp erm) oznacza, e wystpuje oporno na wszystkie makrolidy, linkozamidy, telitromycyn i streptograminy grupy B, ale nie na streptograminy grupy A. Tak wic preparat zoony ze streptograminy grupy A i streptograminy grupy B, chinupristyna/dalfopristyna ze wzgldu na zachowan wraliwo na dalfopristyn (streptogramina grupy A) i mimo opornoci na chinupristyn (streptogramina grupy B) zachowuje aktywno wobec S. aureus i innych gronkowcw. Traci jednak swoje dziaanie bakteriobjcze [15]. Ma to znaczenie np. w leczeniu zakae powodowanych przez szczepy MRSA, zwaszcza jeeli konieczna jest terapia antybiotykiem dziaajcym bakteriobjczo, jak to ma miejsce w wypadku endocarditis.

Jeli zostanie stwierdzone wystpowanie indukowalnej opornoci MLSB, oznacza to e klindamycyna, telitromycyna i streptograminy zachowuj swoj skuteczno. Jednake klindamycyna i telitromycyna nie powinny by stosowane, zwaszcza w leczeniu cikich infekcji gronkowcowych, poniewa podczas takiej terapii moe dochodzi do selekcji mutantw z konstytutywn opornoci MLSB. Brak skutecznoci terapii za pomoc klindamycyny w takich wypadkach zosta ju wielokrotnie opisany [5, 16, 17]. Przy indukowalnej opornoci MLSB utrzymuje si bakteriobjcze dziaanie chinupristyny/dalfopristyny, poniewa streptograminy grupy B nie s induktorami opornoci MLSB. Jeli zostanie stwierdzony fenotyp opornoci MSB (genotyp msr (A)), to zastosowanie w terapii klindamycyny, podobnie jak zaliczanej do ketolidw telitromycyny, nie budzi zastrzee.

Paciorkowce (tab. 3). Konstytutywna oporno MLSB oznacza u paciorkowcw pen krzyow oporno pomidzy wszystkimi makrolidami, linkozamidami i streptogramidami grupy B. Zachowana jest natomiast aktywno telitromycyny i nie dochodzi do selekcji opornych mutantw [4]. W terapii zakae powodowanych przez paciorkowce z indukowaln opornoci MLSB nie naley stosowa ani makrolidw, ani klindamycyny. Wykazanie fenotypu opornoci M (genotyp mef (A)) wskazuje na wystpowanie opornoci wobec wszystkich makrolidw z 14- i 15-czonowym piercieniem laktonowym. Natomiast makrolidy z 16-czonowym piercieniem laktonowym, ketolidy, klindamycyna i streptograminy zachowuj aktywno.

b-laktamazy o rozszerzonym zakresie aktywnoci

Mechanizmy opornoci. Najczstsz przyczyn opornoci paeczek Enterobacteriaceae na cefalosporyny III generacji (np. cefotaksym, ceftriakson, ceftazydym), powodowanej przez b-laktamazy, jest nadprodukcja kodowanych chromosomalnie b-laktamaz AmpC (nazywanych take b-laktamazami klasy C lub grupy 1). Ten typ opornoci zosta opisany pocztkowo u Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marcescens, a pniej take u Pseudomonas aeruginosa, ktre wykazyway oporno na cefalosporyny grupy oksyimino- (cefotaksym, ceftazydym), cefoksytyn i monobaktamy.

W 1980 roku po raz pierwszy, a w nastpnych latach coraz czciej stwierdzano oporno na cefalosporyny III generacji u Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis i Salmonella enterica, ktre nie wykazyway indukowalnego enzymu AmpC. Oporno ta bya przenoszona na plazmidach kodujcych tzw. b-laktamazy o rozszerzonym zakresie aktywnoci (ESBL) [18]. Enzymy te wywodz si od b-laktamaz typu TEM i SHV. Powstay one w wyniku punktowych mutacji w genach, ktre doprowadziy do zamiany aminokwasw. Zakres aktywnoci b-laktamaz wywodzcych si z enzymw TEM obejmuje oksyimino-cefalosporyny i monobaktamy. Nie obejmuje natomiast 7-b-metoksy-cefalosporyny (cefoksytyny). Co wicej, enzymy te s hamowane przez inhibitory b-laktamaz, ktre generalnie nie s aktywne w stosunku do b-laktamaz typu AmpC. Plazmidy zawierajce geny kodujce ESBL s czsto przenoszone w czasie koniugacji na inne paeczki jelitowe ponad granicami gatunkowymi, co powoduje bardzo szybkie horyzontalne szerzenie si tego typu opornoci. U Enterobacteriaceae coraz czciej stwierdza si take ESBL typu CTX-M. U Pseudomonas aeruginosa wystpuj gwnie ESBL typu OXA i PER. Istnieje ju ponad 150 rnych wariantw tych enzymw o rnorodnych cechach fenotypowych*. Fenotypowa ekspresja opornoci na cefalosporyny III generacji i monobaktamy zwizana z produkcj ESBL jest niezwykle zmienna [18, 19], std te badane szczepy mog wykazywa in vitro w stosunku do jednej lub wielu substancji redni lub nawet pen wraliwo. Wykrycie w rutynowej diagnostyce fenotypu opornoci ESBL jest niezwykle trudne. Identyfikacja takich szczepw i uzaleniona od niej interpretacja wynikw maj jednake olbrzymie znaczenie kliniczne, co zostao stwierdzone w wielu badaniach [20, 21]. W wypadku inwazyjnych zakae powodowanych przez Klebsiella spp. lub E. coli produkujcych ESBL dochodzio do statystycznie istotnie wyszej czstoci niepowodze terapeutycznych, gdy stosowano te cefalosporyny, w stosunku do ktrych w badaniach in vitro bakterie wykazyway wraliwo lub byy rednio wraliwe.

Epidemiologia

ESBL najczciej stwierdza si u E. coli, K. pneumoniae i K. oxytoca. Mog one jednak wystpowa take u innych Enterobacteriaceae, jak np. Proteus spp., Citrobacter spp., Salmonella enterica, Enterobacter spp. i Morganella morganii. Czsto wystpowania ESBL jest rna w rnych krajach. Na poudniu i wschodzie Europy wynosi ona 20–50%, natomiast w krajach Europy rodkowej i Pnocnej, takich jak Finlandia, Szwecja i Niemcy, ale rwnie w Hiszpanii, szczepy produkujce ESBL s jeszcze rzadko spotykane (< 1–10%) [22]. W najnowszych badaniach PEG, dotyczcych opornoci wykazano czsto wystpowania szczepw produkujcych ESBL, wynoszc 8,2% dla Klebsiella pneumoniae, 1,3% dla Klebsiella oxytoca i 0,8% dla Escherichia coli (Dane referencyjne PEG: http://www.antiinfectives-intelligence.de/peg/ag_resistenz/main.htm). Trzeba jednak stwierdzi, e czsto wystpowania szczepw z ESBL moe by, podobnie jak w wypadku MRSA, bardzo zrnicowana lokalnie.

Diagnostyka

Nie ma metody badania wraliwoci w laboratorium diagnostycznym, umoliwiajcej wykrycie ESBL ze 100% czuoci. Uznajc zasad diagnostyki stopniowej, powinno si najpierw przeprowadzi badanie skriningowe, a po stwierdzeniu wystpowania szczepw produkujcych ESBL – dodatkowe badanie potwierdzajce. Zalecenie to obowizuje rwnie w stosunku do metod zautomatyzowanych, ktre rni si znacznie co do czuoci i swoistoci.

Do bada skriningowych pod ktem istnienia ESBL zalecane jest stosowanie cefalosporyn III generacji (cefotaksymu, ceftriaksonu, ceftazydymu, cefpodoksymu)

i monobaktamu (aztreonamu). Amerykaski system NCCLS podaje kryteria przesiewowego wykrywania obecnoci ESBL zarwno dla metody oznaczania MIC, jak i dla testu dyfuzji w agarze (tab. 4)

Co ciekawe, te wartoci graniczne dla wszystkich antybiotykw z wyjtkiem cefpodoksymu, mieszcz si jeszcze w zakresie wraliwoci. Pierwotne wartoci graniczne dla cefpodoksymu zostay ostatnio zrewidowane, poniewa czsto prowadziy do faszywie dodatnich wynikw i nieuzasadnionego podejrzewania wystpowania ESBL [23]. Po przyjciu nowych wartoci granicznych wyranie spada czuo cefpodoksymu jako wskanika przesiewowego [24]. Nie ma pojedynczej substancji, ktra z wysok czuoci umoliwiaaby wykazanie wszystkich enzymw ESBL i dlatego powinno si w badaniach skriningowych stosowa kilka rnych zwizkw.

W rutynowej diagnostyce jako test potwierdzajcy zalecane s:

- test badania synergizmu za pomoc dwch krkw (DD test);

- zblieniowy test dwch krkw (DD test);

- test rnicowania MIC;

- E-test ESBL (AB Biodisk).

Stosujc test badania synergizmu za pomoc dwch krkw, okrela si rnic midzy rednic strefy zahamowania wzrostu dla cefotaksymu (30 mg) a rednic strefy zahamowania dla cefotaksymu/kwasu klawulanowego (30/10 mg) lub rnic midzy rednicami stref zahamowania wzrostu dla ceftazydymu (30 mg) i ceftazydymu/kwasu klawulanowego (30/10 mg) (ryc. 3). Pary musz by badane rwnolegle. Rnica 5 mm lub stosunek rednic stref zahamowania wzrostu 1,5 przynajmniej w jednej z obu kombinacji wskazuje na istnienie ESBL [25]. To samo dotyczy cefpodyksymu (10 mg) i cefpodyksymu/kwasu klawulanowego (10/1 mg) [24]. Odpowiednie krki testowe s dostpne w handlu.

W wypadku zblieniowego testu DD wok centralnego krka z amoksycylin/kwasem klawulanowym w odlegoci 20–30 mm, mierzonej od rodkowego punktu krka ukada si krki z cefotaksymem, ceftazydymem, cefpodoksymem, cefepimem lub inne krki nasycone odpowiednimi antybiotykami. Dodatni efekt synergizmu, prowadzcy do odksztacenia si stref zahamowania, wskazuje na istnienie ESBL (ryc. 4). Nakadajc wok krka centralnego kilka krkw z rnymi antybiotykami, uzyskuje si lepsz wykrywalno ESBL.

Wykazanie podczas oznaczania wartoci MIC rnicy rwnej co najmniej trzem kolejnym rozcieczeniom midzy cefotaksymem i ceftazydymem

a tymi antybiotykami w zestawieniu z kwasem klawulanowym (4 mg/ml) wskazuje na wystpowanie ESBL (NCCLS 2000).

Alternatywny sposb okrelania MIC stanowi E-test ESBL (AB Biodisk). Paski E-testu nasycone s cefotaksymem i cefotaksymem/kwasem klawulanowym lub ceftazydymem i ceftazydymem/kwasem klawulanowym, naniesionymi w gradiencie ste. Na obu skalach mona odczyta odpowiednie wartoci MIC. Oba paski testowe naley bada rwnolegle. Rnica MIC rwna lub wiksza od trzech kolejnych rozciecze, przynajmniej w jednej z obu kombinacji, potwierdza wystpowanie ESBL (ryc. 5). Dyfuzja kwasu klawulanowego moe prowadzi do odksztacenia eliptycznych stref zahamowania wzrostu dla cefotaksymu lub ceftazydymu, co uniemoliwia odczytanie MIC. Zgodnie z informacjami producenta wynik ten wskazuje na obecno ESBL. Jeli wartoci MIC mieszcz si powyej lub poniej zakresu pomiarowego, fenotyp nie moe zosta oznaczony [26].

Rne zautomatyzowane systemy oznaczania opornoci, takie jak np. VITEK-2 (BioMerieux) lub PHOENIX (Becton Dickinson), wykazuj wystarczajc czuo i swoisto w identyfikacji szczepw E. coli i Klebsiella spp. produkujcych ESBL. Jednake w jednym z bada system VITEK 2 nie umoliwi wykrycia 5 z 34 typowanych molekularnie izolatw produkujcych ESBL, a w systemie PHOENIX przy czuoci 100% odsetek wynikw faszywie dodatnich by wysoki [27]. Moe si to wiza si z faktem, e system ten opiera si na algorytmie przyjmujcym dla cefpodoksymu warto graniczn 2 mg/ml.

Weryfikacja rnych testw skriningowych i potwierdzajcych obowizuje gwnie dla E. coli

i Klebsiella spp. U innych Enterobacteriaceae, ktre nie posiadaj indukowalnych b-laktamaz AmpC, testy te prawdopodobnie mona stosowa analogicznie. Problemy z wykrywaniem ESBL mog wystpi zwaszcza u Enterobacter spp., Serratia spp. i Citrobacter freundii, ktre produkuj b-laktamazy AmpC, poniewa dochodzi tu do nakadania si rnych fenotypw opornoci. Z uwagi na to, e b-laktamazy AmpC nie s hamowane przez kwas klawulanowy, nie dochodzi do zmiany MIC ani te zmiany rednicy strefy zahamowania wzrostu w wypadku tradycyjnych metod potwierdzania obecnoci ESBL. Oporno na cefoksytyn wskazuje na istnienie b-laktamazy AmpC. Bakterie produkujce ESBL s z reguy wraliwe. Odwrotnie wyglda to dla cefalosporyn IV generacji (cefepimu i cefpiromu). U bakterii wytwarzajcych ESBL czsto obserwuje si podwyszone wartoci MIC (przynajmniej w zakresie rednich wartoci), natomiast cefalosporyny IV generacji s aktywne w stosunku do Enterobacteriaceae produkujcych AmpC. Dlatego te do wykazania jednoczesnego istnienia ESBL i AmpC zaproponowano zastosowanie kombinacji lekw cefepim i cefepim/kwas klawulanowy (E-test ESBL, AB Biodisk) lub cefpirom (30 mg) i cefpirom/kwas klawulanowy (30/7,5 mg) (test dyfuzji z krka w agarze, Oxoid).

Za wynik dodatni dla E-testu-ESBL z cefepimem uwaa si rnic MIC rwn lub wiksz ni trzy kolejne rozcieczenia, a dla krkw zawierajcych cefpirom – rnic rednic stref zahamowania 4 mm. Weryfikacja tych bada wymaga jeszcze dalszych prac. Do kontroli jakoci diagnostyki w kierunku ESBL zaleca si szczep K. pneumoniae ATCC 700603 z SHV-18 ESBL. Strefy zahamowania wzrostu dla rnych antybiotykw wykorzystywanych w metodach skriningowych powinny wynosi dla cefpodoksymu 9–16 mm, ceftazydymu 10–18 mm, aztreonamu 9–17 mm, cefotaksymu 17–25 mm a dla ceftriaksonu 16–24 mm. Rnica rednic stref zahamowania wzrostu w tecie badania synergizmu za pomoc dwch krkw powinna by dla cefpodoksymu i ceftazydymu 5 mm, a dla cefotaksymu 3 mm. Przy okrelaniu wartoci MIC musz zosta osignite standardy zdefiniowane dla ESBL (NCCLS 2002).

Ostateczne wykazanie typu ESBL moliwe jest jedynie w laboratoriach referencyjnych przez okrelenie punktu izoelektrycznego oraz za pomoc metody PCR przez amplifikacj genw ESBL i nastpujce po niej sekwencjonowanie nukleotydw.

Jak ju wczeniej wspomniano, z powodu wzrastajcej rnorodnoci b-laktamaz nie istnieje jedna, absolutnie pewna metoda bada, umoliwiajca wykazanie ESBL. Najwaniejszym warunkiem w diagnostyce jest waciwa identyfikacja drobnoustrojw do poziomu gatunku, poniewa np. Klebsiella pneumoniae i Klebsiella oxytoca mog wykazywa rne mechanizmy opornoci. Najbardziej podstawowym warunkiem bada skriningowych jest zastosowanie cefpodyksymu. Lepsze rozwizanie stanowi zastosowanie ceftazydymu (najlepszego wskanika produkcji enzymw ESBL wywodzcych si z b-laktamaz typw TEM i SHV) oraz cefotaksymu (wskanik dla CTX-M). Kady izolat o obnionej wraliwoci na jedn z tych trzech substancji musi by sprawdzony za pomoc testw potwierdzajcych.

Dokonujc wyboru testu potwierdzajcego, naley rozway wady i zalety poszczeglnych metod. Z pewnoci najdroszy jest E-test. Jego zalet stanowi jednak najmniejsza zaleno od bdw technicznych. W wypadku zblieniowego testu dwch krkw szczeglnie wane jest np. zachowanie zaoonej odlegoci pomidzy poszczeglnymi krkami testowymi. Jeli przeprowadza si rutynowe badanie wraliwoci metod zautomatyzowan, wystpowanie ESBL naley w kadym wypadku potwierdzi inn metod.

Interpretacja bada. W razie wykazania obecnoci ESBL wszystkie penicyliny i cefalosporyny nie skojarzone z inhibitorami powinny by uznane za nieskuteczne. W stosunku do wielu szczepw E. coli i Klebsiella spp. produkujcych ESBL skuteczna jest piperacylina w skojarzeniu z inhibitorami b-laktamaz (w ciszych postaciach zakae stosuje si piperacylin/tazobaktam, w lejszych mona zastosowa tykarcylin/kwas klawulanowy; skuteczno kliniczna cefoperazonu/sulbaktamu wymaga jeszcze potwierdzenia w szerszych badaniach przyp. tum.). Typow cech dla szczepw E. coli i Klebsiella spp. produkujcych ESBL jest utrzymujca si w wielu przypadkach skuteczno cefamycyn, np. cefoksytyny (przyp. tum. pomimo wraliwoci mikrobiologicznej leki te przewanie nie s skuteczne kliniczne wobec szczepw ESBL+). Lekami z wyboru, ktre prawie zawsze s skuteczne w terapii empirycznej cikich postaci zakae i przy podejrzeniu wystpowania ESBL, s karbapenemy (imipenem, meropenem i ertapenem). Mog je zastpi fluorochinolony (np. ciprofloksacyna), jednake – zwaszcza w wypadku szczepw Klebsiella pneumoniae produkujcych ESBL – naley si liczy z moliwoci wystpienia opornoci na te leki.

tumaczenie: Jacek Brych

konsultacja i opracowanie:

dr n. biol. Agata Pietrzyk

prof. dr hab. med. Piotr B. Heczko

* http://www.lahey.org/studies/webt.stm#SHV

Pimiennictwo:

1. Douthwaite S.: Structure-activity relationships of ketolides vs. macrolides, Clin Microbiol Infect 2001, 7 (Suppl 3), 11–7.

2. Leclercq R.: Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications, Clin Infect Dis 2002, 34, 482–92.

3. Douthwaite S., Champney W. S.: Structures of ketolides and macrolides determine their mode of interaction with the ribosomal target site, J Antimicrob Chemother 2001, 48 (Suppl 1), 1–8.

4. Felmingham D.: Microbiological profile of telithromycin, the first ketolide antimicrobial, Clin Microbiol Infect 2001, 7 (Suppl 3): 2–10.

5. Drinkovic D. i wsp.: Clindamycin treatment of Staphylococcus aureus expressing inducible clindamycin resistance, J Antimicrob Chemother 2001, 48, 315–6.

6. Montanari M. P. i wsp.: Differentiation of resistance phenotypes among erythromycin-resistant pneumococci, J Clin Microbiol 2001, 39, 1311–5.

7. Leclercq R.: Overcoming antimicrobial resistance: profile of a new ketolide antibacterial, telithromycin, J Antimicrob Chemother 2001, 48 (Suppl 1), 9–23.

8. Vester B., Douthwaite S.: Macrolide resistance conferred by base substitutions in 23S rRNA. Antimicrob Agents Chemother 2001, 45: 1–12.

9. Appelbaum P. C.: Resistance among Streptococcus pneumoniae: Implications for drug selection, Clin Infect Dis 2002, 34, 1613–20.

10. Leclercq R. i wsp.: Phenotypic expression and genetic heterogeneity of lincosamide inactivation in Staphylococcus spp., Antimicrob Agents Chemother 1987, 31, 1887–91.

11. Reinert R. R. i wsp.: Macrolide-resistant Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes in the pediatric population in Germany during 2000–2001, Antimicrob Agents Chemother 2003, 47, 489–93.

12. Farrell D. J. i wsp.: Molecular characterization of macrolide resistance mechanisms among Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes isolated from the PROTEKT 1999-2000 study, J Antimicrob Chemother 2002, 50 (Suppl 1), 39–17.

13. Schmitz F. J. i wsp.: Prevalence of macrolide-resistance genes in Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium isolates from 24 European university hospitals, J Antimicrob Chemother 2000, 45, 891–4.

14. Waites K. i wsp.: Use of clindamycin disks to detect macrolide resistance mediated by ermB and mefE in Streptococcus pneumoniae isolates from adults and children, J Clin Microbiol 2000, 38, 1731–4.

15. Cocito C. i wsp.: Inhibition of protein synthesis by streptogramins and related antibiotics, J Antimicrob Chemother 1997, 39 (Suppl. A), 7–13.

16. Watanakunakorn C.: Clindamycin therapy of Staphylococcus aureus endocarditis. Clinical relapse and development of resistance to clindamycin, lincomycin and erythromycin, Am J Med 1976, 60, 419–25.

17. Panagea S., Perry J. D., Gould F. K.: Should clindamycin be used as treatment of patients with infections caused by erythromycin-resistant staphylococci?, J Antimicrob Chemother 1999, 44, 581–2.

18. Strenburg E., Mack D.: Extended-spectrum beta-lactamases: Implication for the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection control, J Infect 2003, 47, 273–95.

19. Bradford P. A.: Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat, Clin Microbiol Rev 2001, 14, 933–51.

20. Kim Y. K. i wsp.: Bloodstream infections by extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in children: epidemiology and clinical outcome, Antimicrob Agents Chemother 2002, 46, 1481-1491.

21. Paterson D. L. iwsp.: Outcome of cephalosporin treatment for serious infections due to apparently susceptible organisms producing extended-spectrum beta-lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory, J Clin Microbiol 2001, 39, 2206–12.

22. Babini G. S., Livermore D. M.: Antimicrobial resistance amongst Klebsiella spp. collected from intensive care units in Southern and Western Europe in 1997-1998, J Antimicrob Chemother 2000, 45, 183–9.

23. Gibb A. P. i wsp.: Cefpodoxime screening of Escherichia coli and Klebsiella spp. by Vitek for detection of organisms producing extended-spectrum beta-lactamases, Diagn Microbiol Infect Dis 2000, 38, 2557.

24. Carter M. W. i wsp.: Detection of extended-spectrum beta-lactamases in klebsiellae with the Oxoid combination disk method, J Clin Microbiol 2000, 38, 4228–32.

25. M’zali F. H. i wsp.: Detection of extended-spectrum beta-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of the MAST DD test, the double disc and the Etest ESBL, J Antimicrob Chemother 2000, 45, 881–5.

26. Florijn A. i wsp.: Comparison of E-test and double disk diffusion test for detection of extended spectrum beta-lactamases, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002, 21, 241–3.

27. Strenburg E. i wsp.: Comparison of Phoenix and Vitek2 automated susceptibility test systems for ESBL detection in Escherichia coli and Klebsiella spp. clinical isolates, Diagn Microbiol Infect Dis 2003, 45, 29–34.